wtorek, 4 maja 2010

Izolacja RNA in depth FAQ

Zastanowiło mnie to, ile osób wpada na bloga szukając informacji o izolacji RNA. Czyżby moda na analizy transkryptomu?
W sumie jest to jedna z niewielu rzeczy, na których się znam więc opiszę to po studencku, w detalach, jako i mnie kiedyś uczyli*.

Celem każdej izolacji jest wyodrębnienie z mrowia cząsteczek tych, które nas interesują i wysłanie reszty, która dla nas jest śmieciem, wpizdu.
Nie jest to nigdy proces jednoetapowy, raczej coś jak obieranie cebuli: warstwa po warstwie.
W przypadku RNA jest jeszcze pewna przeszkoda: jest ono bardzo podatne na degradację RNAzami, które słyną ze swej wytrzymałości. W sumie nic dziwnego, bronią nas przed inwazją niepożądanej informacji spoza ustroju- tu jednak potrafią być wrzodem na de.

A więc środki obronne: woda wolna od RNAz (najczęściej tzw. woda DEPC- po przepis na samodzielną deRNA-tyzację zapraszam np. na labrata). Poza tym rękawiczki. Nie chuchać i nie pluć do próbówki, nie czesać się przy otwartych eppendorfach itp itd... I to tyle. Niektóre laby popadają w paranoję słysząc o RNAzach: pracowałam kiedyś w miejscu, w którym istniał kąt "tylko do izolacji RNA", gdzie nie mogło nic stać, blaty odkażało się co pół godziny, próbówki z materiałem nie mogły być wyciągane z lodu ani na moment- takie tam kwiatki. Apeluję więc o rozsądek...

Jak więc się "to" robi? Obecnie najczęściej metodą Chomczyńskiego (trizolową) lub kolumienkową. Chociaż są podobno wariaci, którzy dalej korzystają z chlorku cezu. Z ciekawości można zajrzeć pod ten link żeby wczuć się w klimat, ale chyba tylko izolacje z wyjątkowo "zacukrzonych i zagumowanych" roślin zmuszają człowieka do 20 godzinnego wirowania w ultrawirówce...

Nawiasem mówiąc upierdliwość powyższej metody była bodźcem dla prof. Chomczyńskiego do znalezienia lepszego sposobu i tak narodził się trizol. Jest to potężna miesznka lizująca. Powinni jej używać przy kręceniu horrorów- sądzę że rozpływające się w wielkiej kadzi trizolu ciało byłoby widokiem dla koneserów. Wróć... nie o tym miałam pisać.
...
Do izolacji najlepiej użyć świeżych tkanek, RNA z czasem degraduje, więc im tkanka świeższa, tym lepiej. Należy ją zhomogenizować (tu już zależy od tkanki jakim sposobem, z krwią/szpikiem/kulturą zawiesinową jest najłatwiej). Drobne skrawki tkanki/pellety z komórek zawiesza się w trizolu (zwykle 1ml) i czeka się na upłynnienie zawartości. Trizol to mieszanina głównie fenolu, izoamylu i izotiocyjanianu guanidyny (reszta to tajemnica producenta). Ten etap służy wprowadzeniu chaosu w błony białkowo-lipidowe: izotiocyjanian to mocna sól chaotropowa, która szybko destabilizuje zarówno oddziaływania między, jaki i wewnątrzkomórkowe. I bardzo skutecznie denaturuje białka, nawet upiorne RNAzy. A więc do tego momentu włacznie RNA jest całkowicie bezpieczne. Musicie jednak wiedzieć o ciemnej stronie izotiocyjanianu: nawet jego małe ilości są bardzo aktywne względem wszelkich białek, więc raz: uwaga na wasze łapki. Dwa: każde zanieczyszczenie RNA izotiocyjanianem na końcowym etapie izolacji zniszczy wasze polimerazy, odwrotne transkryptazy, restryktazy i inne azy, których potem dodacie do RNA. Miarą zanieczyszczenia RNA "chaotropami" jest niski stosunek A260/230 (poniżej 1,4 jest już raczej źle, ideał to 1,95-2,25) i pojedyncza"górka" z lewej strony na wykresie absorbancji (orazek czystego RNA poniżej).
W tizolu RNA można dość długo przechowywać w zamrażarce.


kolejny krok to dodanie chloroformu (zwykle 200ul): ekstrakcja chloroformem pozwala na oddzielenie fazy wodnej z RNA od organicznej fazy śmieciowej (ciała komórek, białka i inne smutne resztki) i interfazy (większość DNA). Po zvortexowaniu i zwirowaniu wg protokołu przenosimy fazę wodną do świeżych próbówek. Jeżeli zasiorbiemy tu frakcji organicznej bądź interfazy, otrzymamy albo zabiałczoną próbkę, albo DNA zamiast RNA (mocno zawyżona w stosunku do faktycznej wartość absorbancji!). Lepiej nie zebrać do końca, niż przesadzić. W przypadku roślin z dużą zawartością polifenoli, cukrów itp można etap chloroformowy powtórzyć, ale jeśli można tego uniknąć, to lepiej sobie darować.
Ważne: po dodaniu chloroformu i wstrząśnięciu poczekajmy aż fazy sie rozdzielą i dopiero tak rozwarstwione wkładajmy do wirówki. Interfaza będzie bardziej zbita niż w przypadku gdy od razu po wstrząśnięciu zaczniemy wirować.

Do tego co zebraliśmy dodajemy następnie 0,5ml izopropanolu. Alkohole "osuszają" środowisko wokół kwasów nukleinowych, strącając je z roztworu a o to nam generalnie chodzi od początku. Jeżeli w roztworze strąci nam się kłaczek, to mamy tam DNA. Możemy spróbować zebrać ile się da pipetą, ale całego się nie pozbedziemy. Jeśli kłaczka nie ma, czekamy chwilę aż roztwór lekko zmętnieje, po czym wirujemy. Po wirowaniu powinniśmy otrzymać bielutki pellecik na dole probowki. Jest on dość kleisty i zwięzły, powinien trzymać się dna próbowki. Precypitat zlewamy, uważając by nie wylać dziecka z kąpielą, resztki alkoholu zbieramy pipetą. Dodajemy etanolu 75% by przepłukać nasz cenny kwasik, potem powtarzamy akcję z wirowaniem (tylko na wolniejszych obrotach) ze zlewaniem i odsysaniem resztek etanolu. Ten etap także można powtórzyć jeśli "czujemy", że mogą być tam resztki izotiocyjanianu. Zwykle poprawia to o kilka dziesiętnych A260/230.

Osad suszymy: czy to próżniowo, czy pod nawiewem, czy to termicznie: wsio ryba. Byle to robić tak, by nie napluć i nie nakichać do próbówek. Tu już RNAzy mogą potencjalnie zadziałać. Osad można rozpuścić, gdy stanie sie przezroczysty lub oderwie się od dna próbówki. Lepiej nie przesadzić z czasem suszenia, bo potem trudno będzie go rozpuścić.

Do osadu dodajemy wody DEPC (na czuja, zależy jakie stężenie jest nam potrzebne), rozpuszczamy na termobloku przez max 10 min, lub na lodzie przez jakąś godzinkę. Potem mierzymy stężenie i wsio.

Tu znajdziecie protokół dołączany do trizolu Invitrogenu.

I jeszcze takie tam porady:
-niech wam nie wpadnie do głowy trzymać RNA w buforze z jonami Mg2+ jeśli nie prowadzicie żadnej reakcji enzymatycznej. Jony 2+ szatkują RNA.
-RNA dłużej wytrzyma w zamrażarce niż w temp. pokojowej, a trzymanie na termobloku w 60 stopniach ponad godzinę może zrobić mu kuku. Ale też bez przesady: temperatura pokojowa przez 2-3h go nie zabije, podobnie jak krótkie wygrzewanie.
-RNA lepiej w lodówce nie zostawiać overnight, overweekend czy overweek.
-rozmrażanie i zamrażanie dziesiątki razy żeby pobrać mikrolitr ze stocku jest głupie.
-jeśli chcecie składować RNA powyżej roku, zróbcie z niego cDNA,a jeśli już koniecznie chcecie je później wykorzystać, to zadbajcie by było jak najczystsze. Nawet przechowywane w -80 RNA starzeje się dosyć szybko, szczególnie w wodzie (lepszy jest bufor, np. EB).

15 komentarzy:

  1. dzięki! bardzo pomogło! ;)

    OdpowiedzUsuń
  2. Fajnie napisane:DD Szacun, powinieneś zacząć pisać podręczniki!!!

    OdpowiedzUsuń
  3. Poprawne merytorycznie i napisane w sposób łatwy do przyswojenia

    OdpowiedzUsuń
  4. Super:) Gratulacje:D

    OdpowiedzUsuń
  5. jasno i zrozumiale ! :) idealnie przed jutrzejszym kolosem z biolo molo :D dzięx

    OdpowiedzUsuń
  6. chciałbym się uczyć z książki pisanej w ten sposób!

    OdpowiedzUsuń
  7. miałem straszy ubaw - bezbłędny styl!

    OdpowiedzUsuń
  8. rewelacyjny wpis! bardzo mi się przydał na studia :)

    OdpowiedzUsuń
  9. żebym miała na uczelni takich wykładowców jak Ty... życie byłoby przyjemniejsze :P dzięki serdeczne!

    OdpowiedzUsuń
  10. WOOOOOOOOOOOOOOOOOOW wielkie gratki,az sie przyjemnie uczy:)) od dzisiaj mam Cie w zakladkach:))

    OdpowiedzUsuń
  11. Fajny styl pisania - na luzie o trudnym zagadnieniu, dzięki czemu łatwiej zrozumieć i zapamietać. Szacun :)

    OdpowiedzUsuń
  12. pierwszy raz zrozumial o co tu chodzi dzieki:)

    OdpowiedzUsuń
  13. absolutny szacun. teraz to nawet wygląda jak coś co można zrobić. pisz podręczniki ;)

    OdpowiedzUsuń
  14. Świetny post o Izol. RNA. Mam pytanie o chloroform, czy jest ważne czym jest stabilizowany np. etanolem czy alk. amylowym? Jakiego chloroformu używacie?

    OdpowiedzUsuń
  15. Super opis izolacji! Mam powtórkę przed nadchodzącym kolosem... :D

    OdpowiedzUsuń